В PCR (полимеразна верижна реакция) експерименти, опаковката може да изглежда проста, но директно влияе върху стабилността на реагента, лекотата на използване и надеждните резултати. Независимо дали съхраняването и транспортирането на лаборатория - подготвени реагенти или търговски премикси, овладяването на правилните техники за опаковане на PCR може да избегне общи грешки и да подобри експерименталната ефективност. По -долу споделяме практически съвети за подбор на материали, стратегии за опаковане и детайли за съхранение.
I. Избор на опаковъчни материали: Приоритизиране на съвместимостта и защитата
PCR реакциите са чувствителни към температура, светлина и замърсители, така че опаковъчните материали трябва да отговарят на три ключови изисквания: херметичност, светлина - проверка и химическа инертност.
За центрофугиране и PCR плаки се предпочита полипропилен (PP), поради високата си прозрачност и DNase/RNase - свободни свойства . 0.2 ml тънки - стенирани PCR тръби са идеални за бърз пренос на топлина, докато 0,5 -милионни тръби са по -добри за съхранение на концентрирани реактори на топлината. За 96 - добре PCR плочи, препоръчваме да изберете дизайн на кожи (за лесна манипулация на роботи) или не-наклонен дизайн (за опазване на пространството).
Метод на уплътнение: Конвенционалните тръби за центрофуга използват плоски или повдигнати капачки (за да се предотврати изпаряването и изсушаването). Въпреки това, за дълго - срочно съхранение, топлина - запечатващ филм (като парафилм) или дишащ филм (като Aeraseal) се препоръчва за балансиране на вътрешното и външното налягане. PCR плаките се препоръчват да се използват уплътнители на алуминиево фолио за лепило (високи - температурни устойчиви) или самостоятелно - лепилен филм (за сингъл - употреба).
Защита на светлината: Реагентите, съдържащи светлина -, чувствителни съставки (като определени багрила или праймери) трябва да бъдат обвити в алуминиево фолио или черни PCR плочи (предлагани от някои производители).
II. Техники за аликвотиране: Минимизиране на загубите от многократно замразяване - цикли на размразяване
Аликвотивните реагенти са основна стъпка в PCR опаковането и пряко влияе на експерименталната възпроизводимост.
Master Mix Aliquoting: Търговските главни смеси (като Taq ензим и DNTP микс) се препоръчват да бъдат аликвотирани въз основа на реакционния обем плюс 5% - 10% марж (напр. За 20 μL реакция, аликвота 22 μl per тръба). Избягвайте да използвате директно от насипни опаковки, тъй като многократните цикли на замразяване - могат да доведат до намалена ензимна активност (Taq ензимът може да загуби приблизително 5% активност на цикъл на замръзване-размразяване).
Праймери и шаблони: Праймерите (особено персонализирани праймери) се препоръчват да бъдат аликвотирани от 100 µm запасни разтвори и се съхраняват при - 20 градуса. Разредете се до работна концентрация (обикновено 0,1–1 μm) преди употреба. Шаблони като геномна ДНК трябва да бъдат аликвотирани в единично - да използват количества, за да избегнат кръстосано замърсяване.
Съвети за предотвратяване на замърсяване: Уверете се, че епруветките за центрофуги са сухи преди аликвотиране (остатъчният етанол може да инхибира PCR), Pre - хладни накрайници на пипетата, за да се предотврати залепването на студени реагенти към стената и да износва ръкавици през целия процес, за да се избегне замърсяването на ДНК на кожата.
Iii. Етикетиране и водене на записи: Избягвайте капана на "черната кутия"
Ясното етикетиране е от решаващо значение за PCR опаковки; Неправилното етикетиране може да съсипе целия експеримент.
Задължителна информация за етикетирането: Име на реагент (напр., "2 × Taq Mastermix"), концентрация/съдържание (напр., "10 mm DNTPS"), номер на партидата (за проследяване), условия за съхранение (напр., "-20 градус, защитен от светлина"), дата на аликвота и дата на изтичане (напр. "Използване в рамките на 6 месеца").
Специално етикетиране: Ако реагентът съдържа глицерол (антифриз), багрила (напр. Sybr Green) или добавки (напр. BSA), трябва да се предостави допълнителна информация (напр. „Съдържа 50% глицерол, не съхранявайте при високи температури“).
Синхронизация на запис: Препоръчва се да се използва електронна таблица или софтуер за управление на лаборатория (напр. Labguru), за да се запишат подробните параметри на съдържанието на всяка тръба (напр. Последователност на праймер, стойност на TM) и ги свързвате с номера на физическия етикет.
IV. Съхранение и транспортиране: Балансиране на температурата и физическата защита
Стабилността на PCR реагентите е силно зависима от условията на съхранение и по време на транспортирането се изисква допълнителна защита.
Общо съхранение:
Ензими (Taq, обратна транскриптаза): дълго - срочно съхранение при - 20 градуса (избягвайте многократните цикли на замразяване -размразяване; аликвота и съхраняване на -80 градуса за бъдеща употреба);
Праймери/сонди: Съхранявайте на -20 градуса за повече от 1 година (ако съдържате модифицирана група като биотин, предпазвайте от светлина);
Не - ензимни буфери (напр. PBS): кратко - срочно съхранение на 4 градуса (до 1 месец).
Изисквания за транспорт:
За транспортиране на студена верига използвайте сух лед (- 78 градуса) за ензими (поддържани под -20 градуса) и син лед (около 0 градуса) за буфери за краткосрочен транспорт.
Избягвайте прекомерната вибрация (PCR плочите трябва да бъдат закрепени в кутии от пяна, за да се предотврати смесване на реагенти между кладенци).
По време на високи летни температури добавете изолационен слой към опаковката (напр. Изолационна торбичка с алуминиево фолио + замразен гел пакет).
V. Чести проблеми и решения
Проблем 1: Валежи от реагент (напр. DNTPS или MGCL₂ утаяване при ниски температури) → Разтвор: Накратко центрофуга (1000 об / мин, 1 минута) преди аликвотиране. Разтворете в инкубатор от 37 градуса преди употреба и вихър, за да се смесват подробно.
Проблем 2: Уплътнителят на плочата лесно отлепва → Решение: Изберете топлина - устойчив уплътнител с лепилна подложка или използвайте топлинен уплътнител (подходящ за високо - експерименти с пропускателна способност).
Проблем 3: замъглени етикети → Решение: Използвайте водоустойчив маркер (като Sharpie) или лазер - печатни етикети, за да предотвратите изтриването на почерк от алкохол.
Заключение
PCR опаковката е повече от просто „опаковане“ на реагенти; Това е първата линия на защита за експериментална надеждност. Избирайки подходящи материали, стандартизиране на процеса на аликвотиране, поддържане на задълбочено етикетиране и поддържане на строг контрол на температурата по време на транспортиране, можете значително да намалите човешките грешки, като гарантирате по -стабилни последващи реакции на усилване и по -надеждни резултати. Запомнете: Детайлите определят успеха. Правилните практики за опаковане на PCR могат да спестят значително време за отстраняване на проблеми през целия ви експеримент!